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ELISA试剂盒有哪些

发布时间:2022-11-22      点击次数:51

    ELISA是以免疫学反应为基础,将抗原、9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性。      在实际应用中,通过不同的设计,具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 原理如下: ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。         QQ截图20211125135447.png操作步骤   方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:   1. 包被:用0.05M PH9.�碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。   2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。   3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小时,洗涤。   4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。   5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。   6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测O・D值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O・D值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。   方法二 用于检测未知抗体的间接法:       用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,       每孔加0.1ml,4℃过夜。次日洗涤3次。               ↓       加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔       中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)               ↓       于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,       37℃孵育30-60分钟,洗涤,最后一遍用DDW洗涤。               ↓       其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。   (三) 试剂器材   1. 试剂   (1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):       NaCO31.59克       NaHCO3  2.93克       加蒸馏水至1000ml   (2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS):0.15M       KH2PO4      0.2克       Na2HPO4・12H2O  2.9克       NaCl       8.0克       KCl        0.2克       Tween-20 0.05% 0.5ml       加蒸馏水至1000ml   (3) 稀释液:        牛血清白蛋白(BSA) 0.1克        加洗涤缓冲液至100ml     或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5~10%使用。   (4) 终止液(2M H2SO4):   蒸馏水178.3ml,逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。   (5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸 柠檬酸):     0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml     0.1M 柠檬酸(19.2克/L)      24.3ml     加蒸馏水50ml。   (6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:     TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml     底物缓冲液(PH5.5)    10ml     0.75%H2O2    32μl   (7) ABTS使用液:     ABTS        0.5mg     底物缓冲液(PH5.5)  1ml     3%H2O2   2μl   (8) 抗原、抗体和酶标记抗体。   (9) 正常人血清和阳性对照血清。   2. 器材:   (1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔,ELISA检测仪,50μl及100μl加样器,塑料滴头,小毛巾,洗涤瓶。   (2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。   (3) 4℃冰箱,37℃孵育箱。

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